在進行PCR擴增時，京城會遇到一些問題，需要改變各種影響PCR擴增的參數及條件，以改善反應產物的常量和特異性。

1、沒有得到所希望的PCR擴增產物。

       ①確定是加入酶，檢查酶是否具有活性。

       ②DNA分子解鏈是否充分、完全。

       ③加入的人工合成引物是否爭取。

       ④在未加入Taq DNA聚合酶之前，將反映系統(tǒng)放置在95℃保溫5-10分鐘，以使蛋

         白酶及核酸酶失去活性

2、PCR擴增產物在凝膠電泳中呈片狀。

   ①減少Taq DNA聚合酶的濃度。

   ②增加退火的溫度

   ③降低Mg++的濃度。

   ④減少擴增循環(huán)周期次數。

   ⑤減少退火及延伸的時間。

   ⑥從凝膠中回收與所希望的DNA片段大小相同的DNA,再次進行PCR擴增。

3、凝膠電泳中出現引物二聚體區(qū)帶

   ①檢查引物的3`-端是否互補。

   ②設計較長的引物。

   ③增加靶目標DNA的量。

   ④降低引物的濃度。

   ⑤減少擴增循環(huán)周期次。

   ⑥增加退火的溫度

4、PCR擴增產物特異性不夠

   ①增加退火的溫度。

   ②減少退火及延伸時間。

   ③降低引物和Taq  DNA聚合酶的濃度。

  ④改變Mg++的濃度

預防PCR擴增中污染的措施：

  1、擴增所用的試驗要少量分裝保存，最好為一次實驗的使用。

  2、實驗中實驗人員要穿工作服、戴手套，尤其是RT-PCR擴增的過程中必須戴手套。

  3、實驗中加取標本和反應試劑要迅速、準確、盡量減少標本取樣的次數，并就近操作，避免遠距離一樣，陽性對照最后加入。

  4、PCR擴增實驗中所使用的器械要專用，不可竄用。

  5、實驗中使用的加樣頭，標本處理和擴增用的離心管要高壓滅菌消毒。

  6、加權樣本和擴增產物時，不要反復抽吸和空吸，避免產生氣溶膠，污染實驗室。

  7、要嚴格執(zhí)行先加入反映實際，后加入標本DNA。

  8、擴增過程中的流程要有次序，避免已經入下步驟的擴增標本，返回到前一步驟，造成污染。

PCR擴增過程中污染的主要來源

核算擴增是一項很有效的技術，但同時優(yōu)勢很靈敏的方法以至于很容易出現假陽性的反應，這種假陽性反應的干擾主要產生于3個方面

  1、應用DNA質粒作為核算擴增反應的陽性對照。

  2、DNA由林勇標本，培養(yǎng)物或由被污染的試劑延續(xù)下來。

  3、擴增DNA的污染（即PCR產物）。

PCR擴增產物污染的主要排出方法：

補骨脂類：

補骨脂類過去主要用于治療牛皮癬。其可悲紫外線火花并嵌入DNA分子中，抑制堿基配對。

補骨脂類從反應開始既包含于PCR混合物在熱循環(huán)液中，擴增之后未打開的反應關用紫外線處理之。這種處理使補骨脂素嵌入新行程DNA分子中，并破壞了被處理的DNA重新擴增的可能性。但有一個缺點是增加補骨脂素的量影響DNA在瓊脂糖凝膠中涌動以致給出一個比預期要高的分子量，還有，補骨脂素處理過的DNA嵌入溴化乙錠不如未處理的DNA好。以致染色減弱，然而以內探針所取得的雜交限號則似因補骨脂素的處理二周明顯的影響。

高濃度的補骨脂素可以輕度以致PCR擴增反應，加入10%甘油能夠克服這個問題。