影響紙片擴散法藥敏實驗結(jié)果的因素及其常見誤差的原因

    1959年Kirby-Bower用試管法和紙片法檢查 2000余株葡萄球菌，發(fā)現(xiàn)試管法測出的抗菌藥物的MIC與紙片法測出的菌株環(huán)直徑密切相關(guān)，并在此基礎(chǔ)上制定捷世其結(jié)果的標準表。

1972年美國食品與藥品管理委員（FDA）和國家臨床實驗室標準委員會（NCCIS）推薦紙片法擴散試驗作為藥敏的常規(guī)方法，主要用于需氧菌及生長快的兼性需氧管。

在紙片擴散的過程中，同時存在細菌生長和抗菌素擴散形成的梯度濃度兩種力量之間的對抗，兩種力量可收到不同因素的影響，必須認識這些因素，并加以控制，才能保證結(jié)果的正確。

影響紙片藥敏試驗結(jié)果的因素

1、培養(yǎng)基 應(yīng)不含看菌藥物及拮抗物質(zhì)，蛋白胨中含氨基苯磺酸可使磺胺嘧啶中和，含葉酸代謝產(chǎn)物可使TMP作用時效。不含蛋白胨的牛肉浸液瓊脂平皿可獲得大二清晰的抑菌環(huán)，無胨牛肉浸液瓊脂加入溶解的人血、馬血或兔血則可使抑菌換更清晰。

對培養(yǎng)基的成分和鹽類的濃度應(yīng)保持相對穩(wěn)定，不應(yīng)任意改變，如綠膿桿菌對青大霉素的敏感試驗受鈣、鎂離子的影響很大，Mueller-Hinton瓊脂，基本上不含拮抗物質(zhì)，食欲大多數(shù)病原菌生長。

培養(yǎng)基的厚度應(yīng)為4mm，抑菌環(huán)薄大而厚小，平皿應(yīng)放平澆注、平皿直徑應(yīng)為9-10cm，澆注培養(yǎng)基應(yīng)為25毫升。瓊脂的濃度一般應(yīng)為1.3-1.7%核實，對抑菌環(huán)無影。PH應(yīng)為7.2-7.4，偏酸偏堿對抗菌素的抑菌環(huán)物影響。培養(yǎng)基不應(yīng)加單糖類以免產(chǎn)酸。培養(yǎng)基保存在2-3℃可用一周，成分濃縮，硬度增加等，均不利于細菌生長和擴散，培養(yǎng)基應(yīng)等滲，對營養(yǎng)要求高的細菌，如鏈球菌、肺炎鏈球菌可加入5%羊、兔血等脫纖維血。

2、倍檢菌種量的因素 是中藥的影響因素之一。細菌接種量大，抑菌環(huán)小，菌量過少，抑菌環(huán)相對增大，Waterwrth建議，近融合、半融合生長為宜，被檢菌稀釋濃度的簡易方法有三種；

(1)浸沒法（Flooding法） 取菌落在2毫升蛋白胨水中制成懸液，加在另一支2毫升蛋白胨水中混勻，用滴管吸取菌浸沒培養(yǎng)基，再將多余的菌懸液吸出。

（2）涂抹法（Barry 氏方法之一） 挑取被檢菌菌落，轉(zhuǎn)入無菌肉湯35-37℃培養(yǎng)4-6小時（或轉(zhuǎn)大量菌懸液不孵育），菌液相當(dāng)K-B濁度管0.5號濃度，肉眼比濁，菌液制備15分鐘后用拭子浸沾菌液，將多余的菌液在試管上擠去，然后在平皿旋轉(zhuǎn)60度角涂三次。

（3）重層法（Barry方法之二）挑取被檢菌落4-5個轉(zhuǎn)入0.5毫升腦心浸液肉湯中，于35-37℃，孵育4-5小時，達到/ml，可保持數(shù)小時穩(wěn)定，用標準接種環(huán)，挑取1微升加入9毫升并冷至50℃的1.5%瓊脂MH培養(yǎng)基中，充分混合，重層于已備好的直徑15cm藥敏試驗用MH瓶培養(yǎng)基表面，若為9cm培養(yǎng)皿需含菌瓊脂2毫升。

上訴各種發(fā)放均需開蓋，室溫?zé)o菌放置10-15分鐘使水蒸發(fā)后貼紙片。

藥敏紙片的因素

1、為對藥敏實驗的質(zhì)量控制，應(yīng)由檢驗中心統(tǒng)一制備紙片，用標準菌株做重復(fù)性實驗，各紙片抑菌環(huán)直徑相差不應(yīng)＞1-1.5mm，紙片應(yīng)含等量定量的藥物，冷風(fēng)吹干，不要在37℃溫箱中烘干，以免有些青霉素敏感度下降。

2、紙片藥物的含量對藥敏結(jié)果的影響，紙片藥物的含量是根據(jù)常規(guī)投藥量和該藥物的MIC來確定的，最是含量，能使不同敏感度的菌株抑菌環(huán)明顯區(qū)分開，一般可按權(quán)威單位的推薦含量及出售廠商指定含量，根據(jù)MIC或服藥后血清殺菌試劑或許晴含藥濃度。

3、紙片保存不當(dāng)?shù)挠绊�，一般保存一個月以上（密閉），可由不同程度的下降，低溫干燥條件下4℃缸內(nèi)保存時間長，取出后1小時貼上，開蓋過早，空氣中水蒸氣進入收場音響藥敏。

下圖為粘質(zhì)沙雷氏菌對青霉素G0.00020ug/ml敏感變化情況，在37℃培養(yǎng)實驗中，80%相對溫度條件下30天后，幾乎完全失效。

（4）藥敏紙片的貼附、孵育時間和判斷時間不當(dāng)對藥敏實驗的影響，在9cm平皿培養(yǎng)基上貼7張，紙片間距＞1.5cm，兩片中心相聚＞24mm。貼后不移動，15分鐘后放入35-37溫箱中18-24小時判讀結(jié)果。

     抑菌環(huán)一SIR為分界點，國內(nèi)不論藥物種類或被檢菌相同與否，以抑菌環(huán)直徑＞15mm為敏感（s），10-15mm中毒敏感（I)，＜10mm為耐藥（R)。

除上述的各項影響因素進行質(zhì)控，應(yīng)嚴格遵守執(zhí)行外，還要注意下列幾個問題。

1、抗菌素的選擇，應(yīng)曬糧選定集中，按檢查的菌種而取首選藥物，如有耐藥則另換，因為存在價差耐藥為題，每類抗菌應(yīng)選一種為代表，使臨床醫(yī)師有所了解。

2、紙片擴散使用于生長快的細菌，18-24小時孵育做終點讀取結(jié)果，生長慢的細菌如甲型溶血性鏈球菌等應(yīng)超過24小時觀察結(jié)果。

3、報告方式；應(yīng)報告敏感和耐藥的抗菌藥物，供臨床醫(yī)師選用，有敏感的抗菌藥物，即不應(yīng)寶中毒敏感的抗菌藥物，中毒可做緩沖地帶以減少藥敏實驗的誤差。

4、紙片擴散一般應(yīng)用平皿固體MH培養(yǎng)基，鏈球菌、腸球菌需加血，流感嗜血桿菌需用巧克力培養(yǎng)基。

5、不能再CO2環(huán)境中孵育，以免使瓊脂表面PH受影響(PH降低）。

擴散試驗誤差的原因

實驗條件和技術(shù)上的誤差，對藥敏實驗的準確性影響很大，并且一種誤差可能包含另一種誤差，下面是遇到過的一些原因：

1、沒使用MH培養(yǎng)基。

2、MH培養(yǎng)基制備不當(dāng)，特別是PH調(diào)整不準。

3、使用過期和不當(dāng)儲存的培養(yǎng)基。

4、藥敏紙片制作或保存不當(dāng)。

5、菌液濃度不準。

6、比濁管制備和儲存不當(dāng)和過久。

7、接種時棉拭中過多的菌液沒壓出。

8、未及時將細菌接種于培養(yǎng)基平皿上。

9、接種后沒及時貼附藥敏紙片。

10、貼敷后沒及時孵育。

11、唯獨偏離35℃或大氣中CO2含量過高。

12、時間不粗18-24小時，提前讀取結(jié)果。

13、抑菌環(huán)量取不準確。

14、接種培養(yǎng)物使混合菌。

15、接種培養(yǎng)物使生長慢的細菌或厭氧菌，。

16、沒有質(zhì)控標準菌株對照。

17、沒能正確的將被建軍抑菌環(huán)轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的S、I、R.

原創(chuàng)作者：青島捷世康生物科技有限公司