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蛋白質(zhì)含量的測定——紫外（uv）吸收測定法

點擊次數(shù)：1494　日期：2016/6/13 8:44:30

蛋白質(zhì)含量的測定——紫外（uv）吸收測定法
目的要求
1、了解紫外吸收法測定蛋白質(zhì)含量的原理。
2、掌握紫外分光光度計的使用方法。
實驗原理
    蛋白質(zhì)分子中所含酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)在280nm波長處有最大吸收值。在一定濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值（A280）與其含量成正比關(guān)系，可用作定量測定。
    紫外線吸收法測定蛋白質(zhì)含量的優(yōu)點是迅速，簡便，不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測定。因此，廣泛應(yīng)用在柱層析分離中蛋白質(zhì)洗脫情況的檢測。此法的缺點是：1、對于測定的那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差；2、若樣品中核酸等吸收紫外線的物質(zhì)，會出現(xiàn)較大的干擾。
    不同的蛋白質(zhì)和核酸的紫外線吸收是不同的，即使經(jīng)過校正，測定結(jié)果也還存在一定的誤差。但是可作為初步定量的依據(jù)。該法可測定蛋白范圍應(yīng)在0.1～1.0mg/mL。
試劑和器材
1、標(biāo)準(zhǔn)和待測蛋白質(zhì)溶液
（1）、標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。結(jié)晶牛血清蛋白，預(yù)先經(jīng)微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，根據(jù)其純度配制成1mg/ml蛋白溶液。
（2）、待測蛋白質(zhì)溶液。人血清，使用前稀釋100倍。
2、器材
試管1.5cm×15cm（×9），試管架，移液管1mL（×3）；2mL（×2）；5mL（×2）；分光光度計。
操作方法
1、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線
   取8支試管編號，分別向每支試管加入各種試劑，搖勻。選用光程為1cm的石英比色杯，在280nm波長處分別測定各管溶液的A280值。以A280值為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2、樣品測定
    取待測蛋白質(zhì)溶液1mL，加入蒸餾水3mL搖勻，按上述方法在280nm波長處測定光吸收值，并從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出待測蛋白質(zhì)的濃度。
注意事項
    由于各種蛋白質(zhì)含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，顯色的深淺往往隨不同的蛋白質(zhì)而變化。因而本測定法通常只適用于測定蛋白質(zhì)的相對濃度（相對于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)）。此外，蛋白溶液中存在核酸或核苷酸時也會影響紫外吸收法測定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確性。

原創(chuàng)作者：青島捷世康生物科技有限公司

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