酶聯(lián)免疫吸附測定
目的要求
1、學(xué)習(xí)酶聯(lián)免疫吸附測定原理
2、掌握酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)，定量測定抗體或抗原。
實(shí)驗(yàn)原理
1971年，Engvall和Perlmann發(fā)表了酶聯(lián)免疫吸附劑測定（enzyme linked immunosor-bent assay，ELISA）用于IgG定量測定的文章，使得1966年開始用于抗原定位的酶標(biāo)抗體技術(shù)發(fā)展成液體標(biāo)本中微量物質(zhì)的測定方法。這一方法的基本原理是：使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。再使抗原或抗體與某種酶鏈接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體即保留免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，故可極大地地放大反應(yīng)效果，從而使測定方法達(dá)到很高的敏感度。
根據(jù)檢測目的的不同可將ELISA分為一下幾型：
（1）、直接法。將抗原吸附在載體表面，加酶標(biāo)抗體，形成抗原一抗體復(fù)合物，加底物。底物的降解量=抗原量。
（2）、間接法。將特異性抗原與固相載體鏈接形成固抗相抗原。清晰除去未結(jié)合抗原。加入受檢標(biāo)本使之與固相抗原結(jié)合（樣品中特異性抗體與固相抗原結(jié)合，形成固相抗原-抗體復(fù)合物）。清晰除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。加入酶標(biāo)記抗免疫球蛋白（抗抗體，二抗），它與固相復(fù)合物中的抗體結(jié)合。固相載體上的酶量就代表特異性抗體的含量。加入底物顯色，在20～60min內(nèi)觀察顯色結(jié)果。酶催化底物變?yōu)橛猩a(chǎn)物，根據(jù)顏色反應(yīng)的深度進(jìn)行抗體的定性或定量檢測。
（3）、雙抗體夾心法。將特異性抗體與固相載體鏈接即包被，形成固相抗體。清洗除去未結(jié)合的抗體。加入受檢標(biāo)本使之與固相抗體結(jié)合（樣品中特異性抗原與固相抗體結(jié)合，形成固相抗原-抗體復(fù)合物）。清洗除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。加入酶標(biāo)記抗體。固相免疫復(fù)合物上的抗原就可以與酶標(biāo)記抗體結(jié)合。加入底物顯色，在20～60min內(nèi)觀察顯色結(jié)果。酶催化底物變?yōu)橛猩a(chǎn)物，根據(jù)顏色反應(yīng)的深度進(jìn)行抗原的定性或定量檢測。本法只適用于二價或二價以上大分子抗原，而不適用于半抗原的檢測。
（1）、競爭抑制法。將特異性抗原與固相載體鏈接形成固相抗原。清洗除去未結(jié)合的抗原。同時加入受檢標(biāo)本和抗原使之與固相抗原競樣品中特異性抗體與固相抗原和游離的抗原競爭結(jié)合，形成固相抗原-抗體和游離的抗原-抗體結(jié)合（抗體復(fù)合物）。清洗除去其他未結(jié)合的物質(zhì)和游離的抗原-抗體復(fù)合物。加入酶標(biāo)記抗免疫球蛋白（抗抗體，二抗），它與固相復(fù)合物中的抗體結(jié)合。固相載體上的酶量就代表特異性抗體的含量。加入底物顯色，在20～60min內(nèi)觀察顯色結(jié)果。酶催化底物變?yōu)橛猩a(chǎn)物，根據(jù)顏色反應(yīng)的深度進(jìn)行抗體的定性或定量檢測。
試劑和器材
（1）、試劑
辣根過氧化物酶兔抗鼠IgG，工作稀釋度1:1000。
包被液：0.05mol/L，PH9.6碳酸緩沖液，4℃，保存，Na2CO3,0.15g，NaHCO3，0.293g，蒸餾水稀釋至100mL。
稀釋液及洗滌液：0.01mol/L，pH7.4 PBS-Tween-20,4℃保存，NaCI ,8g，KH2PO4，0.2g，Na2HPO4·12H2O，2.9g，Tween-20，0.5mL，蒸餾水加至1000mL。
封閉液：0.5%雞卵清蛋白，pH7.4PBS。
鄰苯二胺溶液（底物）：臨用前配，0.1mol/L，檸檬酸（2.1g/100mL）6.1mL，0.2mol/L，Na2HPO4·12H2O（7.163g/100mL）6.4mL，蒸餾水12.5mL，鄰苯二胺10mg，溶解后，臨用前加30% H2O2，40uL。
終止液：2mol/L，H2so4。
（2）、材料
取一定量的甲胎球蛋白免疫兔制備抗血清。陰性對照血清。
（3）、器材
聚苯乙烯微量反應(yīng)板（40孔或96孔），可調(diào)試微量吸液器（200uL），封口膜小燒杯，試管，37℃恒溫箱，酶聯(lián)免疫檢測儀。
操作方法
（1）、包被抗原。用包被液將抗原作適當(dāng)稀釋，一般為1～10ug/孔，每孔加200uL，37℃溫育1h后，4℃冰箱放置16～18h。
（2）、洗滌。倒盡板孔中液體，加滿洗滌液，靜放3min，反復(fù)3次，最后將反應(yīng)板倒置在吸水紙上，使孔中洗滌液流盡。
（3）、加封閉液200uL，37℃放置1h。
（4）、洗滌同（2）。
（5）、加被檢血清。用稀釋液將被檢血清作幾種稀釋，每孔200uL。同時作稀釋液對照。37℃放置2h。
（6）、洗滌同（2）。
（7）、加辣根過氧化物酶鼠抗兔IgG，每孔200uL，37℃放置1h。
（8）、洗滌同（2）。
（9）、加底物。鄰苯二胺溶液加200mL，室溫暗處10～15min。
（10）、加終止液：每孔50uL。
（11）、觀察結(jié)果：用酶聯(lián)免疫檢測儀記錄490nm讀數(shù)。
注意事項(xiàng)
（1）、酶標(biāo)記抗體以及待檢樣本的使用濃度應(yīng)事先滴定。
（2）、保存的血清切忌反復(fù)凍融，以免降低血清中抗體或抗原的免疫學(xué)活性。
（3）、酶-底物反應(yīng)時間除人為規(guī)定（常規(guī)規(guī)定為30min）外，還可以陽性參考標(biāo)本的OD值達(dá)到1.0時為反應(yīng)終點(diǎn)。
（4）、底物液一定在臨用前現(xiàn)配。
原創(chuàng)作者：青島捷世康生物科技有限公司
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