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纖維素酶（cellulase，CL）活性測定試劑盒說明書

點擊次數：1184　日期：2017/7/26 15:42:20

 

纖維素酶（cellulase，CL）活性測定試劑盒說明書
 
分光光度法 50 管/24 樣
 
正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義：
 
CL（EC 3.2.1.4）存在于細菌、真菌和動物體內，能夠催化纖維素降解，是一類可廣泛應用于醫(yī)藥、食品、棉紡、環(huán)保及可再生資源利用等領域的酶制劑。
 
測定原理：
 
采用蒽酮比色法測定CL催化纖維素降解產生的還原糖的含量。
 
需自備的儀器和用品：
 
可見分光光度計、水浴鍋、可調式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰、濃硫酸和蒸餾水。
 
試劑的組成和配制：
 
提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存；
 
試劑一：液體 6mL×1 瓶，4℃保存；
 
試劑二：液體 40mL×1 瓶，4℃保存；
 
試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存； 臨用前加入 5mL 蒸餾水和 45mL 濃硫酸充分溶解待用。
 
樣品測定的準備：
 
1、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（104 個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）； 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。
 
2、組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。
 
3、血清（漿）樣品：直接檢測。
 
測定步驟：
 
1、 分光光度計預熱 30min 以上，調節(jié)波長至 620nm，蒸餾水調零。
 
2、加樣表（在 EP 管中依次加入下列試劑）：
 

試劑名稱
 
對照管
 
測定管
 
 
 
 
 
樣本
 
100
 
100
試劑一（μL ）
 
 
 
180
試劑二（μL ）
 
740
 
740
蒸餾水（μL ）
 
360
 
180
37℃振蕩反應 1h 后，90℃水浴 15min（蓋緊，防止水分散失），冷卻后
 
 
8000g 25℃離心 10min，取上清，得糖化液
糖化液 (μL)
350
 
350
試劑三 (μL)
650
 
650

 
混勻， 90℃水浴 10min（蓋緊，防止水分散失），冷卻，620nm 處蒸餾水調零，測定吸光值A，計算 ΔA=A 測定管-A 對照管。每個測定管設一個對照管。
CL 活力計算：
 
1、標準條件下測定的回歸方程為 y = 5.018x - 0.0462；x 為標準品濃度（mg/mL），y 為吸光值。
 
2、血清（漿）CL 活力的計算
 
單位的定義：每 mL 血清（漿）每分鐘催化產生 1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。 CL 活力(μg /min/mL)= [1000×(ΔA+0.0462) ÷5.018×V 反總]÷V 樣÷T =39.8×(ΔA+0.0462)
 
3、細胞、細菌和組織中 CL 活力的計算
 
（1）按照蛋白濃度計算
 
單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產生 1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。 CL 活力(μg /min/mg prot)=[1000×(ΔA+0.0462) ÷5.018×V 反總]÷(V 樣×Cpr) ÷T
 
=39.8×(ΔA+0.0462) ÷Cpr
 
（2）按樣本鮮重計算
 
單位的定義：每 g 組織每分鐘催化產生 1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。
 
CL 活力(μg /min /g 鮮重)=[1000×(ΔA+0.0462) ÷5.018×V 反總]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T
 
=39.8×(ΔA+0.0462) ÷W
 
（3）按細菌或細胞密度計算
 
單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘催化產生 1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。 CL 活力(μg /min /104 cell)=[1000×(ΔA+0.0462) ÷5.018×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T
 
=0.0796×(ΔA+0.0462)
 
1000：1mg/mL=1000ug/mL；V 反總：反應體系總體積，1.2mL； V 樣：加入樣本體積，0.1 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，60 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500 萬。

原創(chuàng)作者：青島捷世康生物科技有限公司

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