動物細胞培養(yǎng)在單克隆抗體制備中的應用
抗體作為疾病預防、診斷和治療的制劑已有上百年的發(fā)展歷史。早期制備抗體的方法是將某些天然抗原經(jīng)各種途徑面議動物，成熟的B細胞可控受到抗原刺激后，將抗體分泌到血清和體液中。實際上血清中的抗體是多種單克隆抗體的混合物，因此稱之為多克隆抗體。多可控抗體 是人類有目的利用抗體的第一步。多克隆抗體的不均一性，限制了對抗體結(jié)構(gòu)和功能的進一步研究和應用。1975年Kohler和Milstein首次用B淋巴細胞雜交瘤技術(shù)制備出均一性的單克隆抗體獲1984年諾貝爾獎。雜交瘤技術(shù)的誕生被認為是抗體工程發(fā)展的第一次質(zhì)的飛躍，也是現(xiàn)代生物技術(shù)發(fā)展的一個里程碑。利用這種技術(shù)這杯的單克隆抗體的疾病診斷、治療和科學研究中得到廣泛的應用。抗體所針對的抗原包括半抗原、具有生物活性的天然產(chǎn)物、神經(jīng)肽、激素、酶和其他蛋白、糖蛋白、脂蛋白、脂多糖、核酸、組織相容性抗原、分化抗原、自身抗原、細胞表面粘附分子等。這些抗原可以來自病毒、支原體、細菌、原蟲、寄生蟲、正常細胞及腫瘤細胞。 雜交瘤抗體技術(shù)的基本原理是通過融合兩種細胞而同時保持兩者的主要特征。這兩種細胞分別是B淋巴細胞和經(jīng)抗原免疫的小鼠細胞做小鼠骨髓瘤細胞。B淋巴細胞的主要特征是它的抗體分泌功能和能夠在選擇培養(yǎng)基中生長（選擇遠離見后），小鼠骨髓瘤細胞則可在培養(yǎng)條件下無線分裂、增殖、即所謂永生性。在選擇培養(yǎng)基的作用下，只有B瞎報與骨髓瘤細胞融合的雜交才具有持續(xù)增殖的能力，形成同時具備抗體分泌功能和保持細胞永生性兩種特征的細胞克隆。
細胞的選擇與融合
建立在雜交瘤技術(shù)的制備針對抗原特異的單克隆抗體所以融合細胞一方必須選擇經(jīng)過抗原免疫的B細胞，通常來源于免疫動物的脾細胞。脾是B細胞聚集的中藥場所，無論以何種免疫方式刺激，脾內(nèi)皆會出現(xiàn)銘心啊的抗體應答反應。融合細胞的另一方則是為了保持細胞融合后細胞的不斷增值，只有腫瘤細胞才具備這種特性。選擇同一體系的細胞可增加融合的成功率。多發(fā)性骨髓瘤是B 細胞系惡性腫瘤。所以是理性的脾細胞融合伴侶。目前常用的B細胞瘤株有：P3-X63-Ag8，P3-NSI/1-Ag4-1,X63-Ag8. 563 Sp2/0-Ag14等，這些細胞株皆為HAT敏感細胞株。
使用細胞融合劑造成細胞膜一定程度的損傷，使細胞抑郁相互粘連而融合在一起。最佳的融合效果應是最低程度的細胞損傷而又產(chǎn)生坐高頻率的融合。聚乙二醇是目前最常用的細胞融合劑，一般應用濃度為40%。
細胞融合是一個瑞吉的物理過程。在小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞呵呵細胞懸中，經(jīng)融合細胞將以多種形式出現(xiàn)。如融合的脾細胞和瘤細胞、融合的細胞和脾細胞、融合的瘤細胞和瘤細胞、未熔合的脾細胞、未熔合的瘤細胞以及細胞的多聚體形式等。正常的脾細胞在培養(yǎng)基中存活僅5-7d，無需特別篩選，細胞的多聚體形式也容易死去。而為融合的瘤細胞則需要驚醒特別的篩選去除
細胞DNA合成一般有兩條途徑。主途徑是由糖和氨基酸合成核苷酸，進而合成DNA，也算作為重要的輔酶參與這一合成過程。意義輔助途徑是次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情況下，經(jīng)次黃嘌呤、氨甲喋呤和胸腺嘧啶核苷，所以取三者的字頭成為HAT培養(yǎng)基、其中氨甲喋呤是也算的拮抗劑，可阻斷瘤細胞利用正常途徑和成DNA，而融合所用的瘤細胞是經(jīng)毒性培養(yǎng)基選出的HGPRT細胞株，所以不能再該培養(yǎng)基中生長。因此只有融合細胞具有親代雙方的遺傳性能，可在HAT培養(yǎng)基中長期存活于繁殖。 在動物勉一中，應選用高純度抗原。一種抗原往往有多個決定簇，一個動物在受到抗原刺激后產(chǎn)生的體液免疫應答，實質(zhì)是眾多B細胞群的抗體分泌。而針對目標抗原表位的B細胞只占極少部分。而且由于細胞融合是隨機的過程，在已經(jīng)融合的細胞中，有相當比例的無關(guān)細胞的融合體，因此需要篩選去除。篩選過程一般分為兩步進行：意識融合稀薄啊的抗體篩選，而是再次基礎(chǔ)上進行的特異性抗體篩選。將融合的細胞驚醒充分稀釋，使分配到培養(yǎng)板的每一孔中的細胞數(shù)在0至數(shù)個細胞之間（30%的孔為0才能保證每個孔中是單個細胞），培養(yǎng)后取上清以ELISA法選出抗體高分泌性的細胞；這一過程常被習慣地稱作單克隆。將這些陽性細胞在進行克隆化，應用特異性抗原包被的ELISA找出針對目標抗原的抗體陽性細胞株，增殖后進行凍存、體外培養(yǎng)或動物腹腔接種培養(yǎng)。 單克隆抗體的制備是一個復雜、精細的工藝。為對全過程有一個概括的了解，一般講全過程分為三個階段；免疫小鼠；建立篩選方法和程序；雜交瘤生成。
上圖每一階段都有可能迅速順利完成，單個階段也都有其本身的問題，需要在實驗開始前予以充分考慮，以免影響全局。動物再注入抗原后，一旦出現(xiàn)良好的液體免疫應答，同時又已建立合用的篩選方法，病通過血清對所建立篩選方法進行評價、確定方法后，才可開始雜交瘤細胞的制備。其過程大致為；在細胞融合前數(shù)日，用抗原免疫動物；將從免疫動物得到的分泌抗體的細胞與骨髓瘤細胞想混，經(jīng)行細胞融合（有效地細胞融合約可得1/10
存活的雜交細胞）；其后，將融合細胞用所選擇的培養(yǎng)基限定稀釋，置多空培養(yǎng)板進行培養(yǎng)，在細胞融合后1周，即可對雜交瘤進行測試，從陽性培養(yǎng)孔所取的細胞先增殖，然后，進行單克隆（即但可控生長），雜交瘤的生成與克隆需要時間，很少的實力只需要2個月，有的甚至要1年時間。因制備但可控抗體過程中每一步都對其后各步影響很大，因此均需zhuy8i選擇最適宜的條件，如：要注意抗原的選擇及其性質(zhì)，如細胞、蛋白質(zhì)、半抗原等；根據(jù)抗原得性質(zhì)和得量和對抗體得要求等，計劃及建立免疫的途徑和方式；選定抗體篩選的測定方法必須簡單、可重復、特異、并可適用于單克隆抗體的最終適用(即免疫熒光、免疫沉淀、功能試驗等中的應用）要確定細胞培養(yǎng)的條件；細胞融合的方式應考慮雜交方法，細胞的選擇和可控的方式等。
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