ELISA中主要的試劑有抗原（體）、酶標(biāo)抗原或抗體、酶和底物等，抗原和抗體是所有的免疫學(xué)反應(yīng)中都必須具備的。酶標(biāo)抗原或抗體是ELISA的核心試劑，這些試劑可以自己制備也有商品試劑（例如酶標(biāo)二抗）銷(xiāo)售。在自己制備酶標(biāo)物時(shí)，除了應(yīng)準(zhǔn)備好純化的抗原和抗體外，還應(yīng)準(zhǔn)備好純化的酶，酶可以從動(dòng)植物組織或微生物中提取，但過(guò)程負(fù)載，而且純度和活性通常很難保證，因此最好從試劑公司公司購(gòu)買(mǎi)。酶和抗原或抗體鏈接方法的基本原理和酶固定化方法的原理相同，常用的方法包括；以戊二醛為教練劑的戊二醛法和過(guò)氧酸鹽為氧化劑的過(guò)氧酸氧化法等。ELISA中常用的酶包括辣根過(guò)氧化物酶（Horseradish Peroxidase,HRP),堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase AP)、葡萄糖氧化鎂(Glucose Oxidase GO)、Bβ-D-半乳糖苷酶和脲酶等，其中HRP和AP最為常用。HRP的底物很多，在ELISA中常用是鄰苯二胺與雙氧水、5-氨基水楊酸與雙氧水等；AP常用的底物是對(duì)硝基酚磷酸酯和酚酞單磷酸酯等。

ELISA的種類(lèi)很多，不同ELISA的具體操作過(guò)程不完全相同，但是基本過(guò)程是一致的。下面以簡(jiǎn)潔競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定黃曲霉毒素B1為例，對(duì)ELISA的具體操作過(guò)程敘述如下。

1、抗原包被（antigen coating)將AFB1與牛許晴白蛋白（BSA)的練街舞AFB1-BSA（也可以是卵清蛋白的練街舞AFB1-OV)溶解于0.1mol/L pH9.5的碳酸鹽緩沖液中獎(jiǎng)溶液加入酶標(biāo)板的微孔內(nèi)，通常每孔加200ul，4℃放置過(guò)夜，去除恢復(fù)至室溫，傾去微孔內(nèi)溶液（包被液），已含有0.05%的TWEEN-20的PH7.0、0.05mol/L磷酸緩沖溶液生理鹽水(PBST)滿(mǎn)孔洗滌3次，每次5min，控干，即得到包被有AFB1-BSA的酶標(biāo)板。在這個(gè)過(guò)程中AFB1-BSA通過(guò)物理吸附包被（粘附）在酶標(biāo)板微孔的內(nèi)壁上，沒(méi)有包被的抗原被洗滌去除。

2、包被抗原的濃度對(duì)ELISA的測(cè)定結(jié)果由較大的影響，濃度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響測(cè)定結(jié)果，如下圖是不同包被濃度時(shí)，競(jìng)爭(zhēng)ELISA的抑制曲線(xiàn)。在圖中可以看出，包被濃度對(duì)靈敏度的影響較大，當(dāng)包被濃度為5ug/ml時(shí)，靈敏度（最小檢出量）達(dá)1.57ng/ml,其他濃度的靈敏度都比該濃度的差，這說(shuō)明5ug/ml是叫合適的包被濃度

從宏觀(guān)上看，包被濃度無(wú)論是過(guò)高還是過(guò)低都表現(xiàn)為靈敏度差，但是從微觀(guān)上分析，他們的情況是不同的，低包被濃度時(shí)，包被抗原的量不足，微孔內(nèi)吸附的抗原量少，可供抗體結(jié)合的抗原決定簇少，從而影響靈敏度高；二高濃度時(shí)包被抗原的量過(guò)多，微孔內(nèi)吸附的抗原包被抗原進(jìn)一步和抗體結(jié)合，降低了靈敏度，因此只有合適的包被抗原濃度，才能得到最好的靈敏度。這種關(guān)系見(jiàn)下圖

2、封阻 所謂封阻是指酶標(biāo)板被抗原包被后，在微孔中加入一定濃度BSA、OV、明膠或脫脂牛奶等溶液以封阻微孔內(nèi)沒(méi)有被抗原包被的空襲，避免抗體非特異性吸附于這些空襲，以提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，常用的封阻劑包括BSA、OV、明膠和脫脂奶等，其中以脫脂牛奶較為便宜，而且封阻效果和其他幾種封阻劑沒(méi)有明顯的差別。

3、抗原抗體競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng) 在酶標(biāo)板的每個(gè)微孔中加入一定量的適當(dāng)稀釋度的抗體（抗血清），同時(shí)分別加入一定量的準(zhǔn)溶液用于做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，混勻，37℃保溫1-2H，包被在酶標(biāo)板上的固定抗原（AFB1-BSA)和添加的AFB1標(biāo)準(zhǔn)品或樣品抽提液中的AFB1游離抗原競(jìng)爭(zhēng)抗體的結(jié)合位點(diǎn)，PBST洗滌扣干3次，游離的抗原抗體符合無(wú)被洗滌去除。

4、酶標(biāo)二抗與抗原抗體復(fù)合物的反應(yīng) 將一定量的適當(dāng)稀釋的酶標(biāo)二抗溶液加入個(gè)反應(yīng)孔，37℃保溫1-2h，酶標(biāo)二抗和抗原抗體符合無(wú)反應(yīng)，形成抗原-抗體-酶標(biāo)二抗的復(fù)合物固定在酶標(biāo)板上，PBST洗滌扣干5次，將有力多余的酶標(biāo)二抗去除。

5、底物顯色反應(yīng)和吸光值的測(cè)定 每孔加反應(yīng)底物100ul（40mg臨本二胺溶于100ml、PH5.0/0.2mol/L檸檬酸0.1mol/l磷酸氫鈉緩沖溶液，加入150ul H2O2,現(xiàn)配現(xiàn)用，37℃保溫保濕，避光反應(yīng)30min，每孔加50ul 2mol/L,H2SO4終止反應(yīng)，5min后，以酶聯(lián)免疫測(cè)定儀于490nm測(cè)吸光度。

6、Elisa競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線(xiàn) 以AFB1標(biāo)準(zhǔn)誤溶液中的AFB1的濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以不同AFB1濃度所對(duì)應(yīng)的吸光值和AFB1濃度為零時(shí)吸光值的比值的百分?jǐn)?shù)（稱(chēng)為競(jìng)爭(zhēng)抑制率）為縱坐標(biāo)，繪制ELISA競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線(xiàn)，根據(jù)樣品抽提液的吸光值，利用競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線(xiàn)，計(jì)算出樣品中AFB1的含量，上述ELISA的操作過(guò)程